技术交流

狂犬病是危害人类健康的最古老疾病之一，由狂犬病病毒引起，人类患者一旦发病，病死率几乎为100%，是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，也是人类尚未能有效控制的疫病之一。狂犬病疫苗是预防狂犬病唯一有效的方法。欧洲和北美的许多国家已持续多年无狂犬病发生，得益于采用狂犬病口服疫苗对野生动物进行诱饵口服免疫。在爱沙尼亚、法国、意大利、瑞士、芬兰等国家大规模应用狂犬病口服疫苗后仅几年就使这些国家消除了狂犬病。对我国2004年至2018年国内动物狂犬病病例进行回顾性调查时发现，0.33%(33/10118)的犬被确诊为狂犬病阳性，阳性犬中29只属于流浪犬，因此在我国对流浪犬进行狂犬病免疫可有效减少人狂犬病的发生。由于狂犬病毒的流行面积和宿主范围非常广泛，单靠注射免疫很难消灭狂犬病毒，特别是对于城市的流浪动物，用口服疫苗大面积免疫是消灭犬狂犬病的最有效方法。

欧美等发达国家从1978年就开始大规模应用减毒活疫苗预防动物狂犬病，并明显降低了野生动物狂犬病的发病率，同时也极大减少了被动物致伤发生的家畜狂犬病和暴露后免疫人数，最终消除了这些国家的人间狂犬病。早期应用于疫苗的减毒株主要有重组痘病毒V－RG株，和一些不同减毒水平的减毒株，如ERA株、SADBern株、SADB19株和SAD5/88株，虽然这些毒株毒力显著减弱，但仍然对小鼠和其他野生动物保留残余毒力，存在传播感染的危害性。相比之下重组疫苗存在较多的优势，不仅安全可靠，而且可通过口腔、胃肠黏膜进行抗原递呈，较传统注射途径免疫效果好且简易便捷。表达狂犬病毒糖蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒活载体疫苗rAd5－ΔE1/E3－CGS已被证实能够产生抗狂犬病毒的保护性抗体，是一种安全、可靠、高效的动物狂犬病候选疫苗，但其稳定性受到饵料制备、储运条件、储存时间及投放环境等因素的影响。为探索rAd5－ΔE1/E3－CGS口服疫苗消减规律，本研究依据饵料制备、储存运输、环境投放等情况设计方案，选取不同剂型疫苗，经储存运输、反复冻融、环境投放不同阶段考察疫苗的效价，并进行统计学分析，为rAd5－ΔE1/E3－CGS口服疫苗的剂型研制、储备运输、免疫程序提供技术参考。

1.1疫苗、犬天然诱食剂、口服疫苗佐剂和细胞

rAd5－ΔE1/E3－CGS(农基安证字(2020)第202号)由军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所提供；犬天然诱食剂由上海诺伦生物医药技术有限公司提供；口服疫苗佐剂由上海市农业科学院畜牧兽医研究所提供；293A细胞购自商城北纳创联生物科技有限公司。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM细胞培养液(批号：2126865)、0.25%浓度胰酶消化液(批号：2142303)均购自GIBCO公司；胎牛血清(批号：2418)购自SIGMA公司；96孔细胞培养板(批号：25200601)购自美国Costar公司。

1.3 口服疫苗制备(见表1)

1.3.1 rAd5－ΔE1/E3－CGSTCID₅₀测定

rAd5－ΔE1/E3－CGS同步接种293A细胞，置37℃含5%CO₂培养箱培养48~72h，待80%细胞出现聚集、圆缩、脱落等细胞病变，将培养液冻融三次，2000r/min离心5min，取上清备用，同时按照Reed－Muench法测定TCID₅₀。

1.3.2 口服疫苗冻干剂制备

将疫苗稀释至1.0×10⁸TCID₅₀/mL，加入等体积的脱脂奶溶液(0.1g/mL)，按照2mL/头份进行分装，真空、冻干，－20℃保存备用，一周以后测定其TCID50。

1.3.3 口服疫苗咀嚼剂制备

将疫苗稀释至1.0×108TCID50/mL，每头份咀嚼剂取1mL病毒液、1mL工作浓度佐剂加入到10g犬天然诱食剂中，充分混匀，用模具压制成骨型，真空、冻干，－20℃保存备用，一周以后测定其TCID₅₀。

1.3.4 口服疫苗喷剂制备

将疫苗稀释至1.0×108TCID50/mL，每头份取1mL病毒液、1mL工作浓度佐剂和1mL脱脂奶溶液(0.1g/mL)充分混匀，真空、冻干，－20℃保存备用，一周以后测定其TCID₅₀。

1.4运输稳定性试验

三种剂型口服疫苗在野外投放前主要通过低温冷链运输，按照最远距离计算从出库至各区疫控中心，再到各免疫点，最后到达投放点时间不超过48h。分别将三种剂型口服疫苗置2~8℃冷藏车内进行48h的运输，期间模拟10次开门卸货入库，每次各取1头份口服疫苗测定其TCID50。待口服疫苗返回后入库储存于－20℃备用，分别于入库后第3、6、9和12个月测定口服疫苗效价。以储存于－20℃未经运输的对应口服疫苗作为对照疫苗。

1.5反复冻融稳定性试验

将通过运输后重新入库的备用疫苗室温放置12h后，再将其回置－20℃冷冻12h，反复5次，每次取1头份测定其TCID50，剩余疫苗重新入库于－20℃以下储存。以储存于－20℃未经冻融的疫苗作为对照疫苗。

1.6不同保存温度下的稳定性试验

将反复冻融后重新入库的备用疫苗分别于2~8℃保存4个月，每隔1个月取样检测疫苗效价；于15℃放置1个月，每周取样检测疫苗效价；于25℃放置1周，每天取样检测疫苗效价；于37℃放置3d，每12h取样检测疫苗效价。均以各温度下0时间点的疫苗作为对照。1.7统计学分析疫苗效价检测结果均采用lgTCID₅₀/头份，保留小数点后2位。用SPSSstatistics软件进行数据的统计及分析，采用单因素方差分析(F)对不同条件下的疫苗进行病毒滴度比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1运输稳定性

结果见图1。三种剂型口服疫苗经过48h运输和开门卸货后，冻干剂效价下降了1.42，咀嚼剂下降了1.00，喷剂下降了1.25，但是三种剂型口服疫苗效价均能达到5.75以上。经统计学分析，在不同开门卸货次数条件下，咀嚼剂相比冻干剂效价差异显著，具有统计学意义(F_咀嚼剂＝14.810，P＜0.05)；喷剂相比冻干剂也同样差异显著，具有统计学意义(F_喷剂＝29.133，P＜0.05)。咀嚼剂、喷剂相对冻干剂效价下降差异显著，具有统计学意义(F_咀嚼剂＝10.529，F_喷剂＝19.803，P＜0.05)。

运输后入库的口服疫苗于－20℃储存3、6、9、12个月的效价变化见图2。运输后－20℃储存，冻干剂疫苗效价下降了0.58，咀嚼剂下降了0.42，喷剂下降了0.92，但是均能达到5.33以上。经统计学分析，在不同时间点条件下，冻干剂、咀嚼剂和喷剂相对对照疫苗效价均差异不显著，无统计学意义(F_冻干剂＝17.488，F_咀嚼剂＝9.418，F_喷剂＝73.846，P＞0.05)；咀嚼剂、喷剂相对冻干剂效价下降差异同样不显著，无统计学意义(F_咀嚼剂＝2.293，F_喷剂＝2.293，P＞0.05)。

2.2 反复冻融稳定性

运输后重新入库的疫苗反复冻融5次后其效价变化见图3。冻融后，冻干剂效价下降了0.92，咀嚼剂下降了0.75，喷剂下降了0.58，但是均能达到5.00以上。经统计学分析，冻融后，咀嚼剂、喷剂相对冻干剂效价差异不显著，无统计学意义(P＞0.05)；咀嚼剂、喷剂相对冻干剂效价下降差异显著，具有统计学意义(F咀嚼剂＝10.529，F喷剂＝19.803，P＜0.05)。

2.3 不同保存温度下疫苗的稳定性

结果见图4。

2.3.1 2~8℃保存4个月

冻干剂效价下降了0.33，咀嚼剂下降了0.67，喷剂下降了0.67，但是均能达到5.00以上。经统计学分析，冻干剂、咀嚼剂相对对照疫苗效价差异不显著，无统计学意义(P＞0.05)；但是喷剂相对对照疫苗效价差异显著，有统计学意义(F_喷剂＝22.894，P＜0.05)；咀嚼剂、喷剂相对冻干剂效价下降差异不显著，无统计学意义(F_咀嚼＝0.982，F_喷剂＝1.549，P＞0.05)。

2.3.2 15℃保存1个月

冻干剂效价下降了1.58，咀嚼剂下降了0.75，喷剂下降了1.34，疫苗效价最低只有3.75。冻干剂、咀嚼剂和喷剂相对对照疫苗效价差异均不显著，无统计学意义(P＞0.05)；咀嚼剂、喷剂相对冻干剂效价下降差异也不显著，无统计学意义(P＞0.05)。

2.3.3 25℃保存1周

冻干剂效价下降了2.66，咀嚼剂下降了2.50，喷剂下降了3.34，疫苗效价最低只有2.50。冻干剂、咀嚼剂和喷剂相对对照疫苗效价差异均不显著，无统计学意义(P＞0.05)；咀嚼剂、喷剂相对冻干剂效价下降差异也不显著，无统计学意义(P＞0.05)。

2.3.4 37℃保存3d

冻干剂效价下降了3.66，咀嚼剂下降了4.00，喷剂下降了3.67，疫苗效价最低只有1.00。冻干剂、咀嚼剂和喷剂相对对照疫苗效价差异均不显著，无统计学意义(P＞0.05)；咀嚼剂、喷剂相对冻干剂效价下降差异也不显著，无统计学意义(P＞0.05)。

腺病毒作为基因传递和表达的有效工具满足了作为重组疫苗载体的诸多条件，目前已经大量的用于疫苗的研发和临床基因治疗领域，其中研究应用最广泛的为人5型腺病毒。rAd5－ΔE1/E3－CGS属于表达狂犬病病毒糖蛋白基因RABV－G的重组复制缺陷型人5型腺病毒活载体疫苗，不仅可以高效表达狂犬病病毒G蛋白，而且其自身的复制缺陷也增加了口服疫苗的安全性，并获得了农业转基因生物安全证书。由于口服疫苗对冷链温度偏移十分敏感，因此在制备、储存、运输、投放过程中的温度和时间控制尤为重要，高温影响疫苗效价，或导致接种无效；低温可影响疫苗形态，直接影响疫苗的安全性和稳定性，且形态变化多是不可逆的，因此在口服疫苗投放使用前，应当对口服疫苗在实际储运和环境释放中疫苗效价的消减规律进行研究。

狂犬病口服疫苗rAd5－ΔE1/E3－CGS在被制备成三种剂型后，效价均有所下降，其中咀嚼剂下降最多，达到1.25，可能与犬天然诱食剂中未添加脱脂奶，冻干后保护能力差有关。在冷链运输和开门卸货后，虽然相对冻干剂，咀嚼剂和喷剂效价差异显著，但是效价下降差异并不显著，疫苗效价仍然保持在最低5.75以上，证明冷链运输中三种剂型口服疫苗均较稳定。运输后储存于－20℃保存1年，三种剂型口服疫苗效价下降最高不超过1.00，最低疫苗效价仍可以达到5.33以上，因此通过运输后进入免疫点－20℃保存的口服疫苗保存期至少可以达到1年。储存于免疫点的口服疫苗投放前会经过反复冻融，冻融5次后效价最高下降了0.92，疫苗效价最低仍可达5.00，冻干剂、咀嚼剂和喷剂相对对照疫苗效价差异不显著，但是咀嚼剂和喷剂相对冻干剂疫苗效价下降差异显著，说明三种剂型口服疫苗对冻融都具有较强的抵抗力，其中咀嚼剂抵抗冻融的效果最佳，说明野外投放的口服疫苗短暂失温并不影响疫苗的效价。

活疫苗效价的下降值与保存时间呈正比关系，但是保存的温度直接影响疫苗效价的下降率。2~8℃为口服疫苗的暂存温度，在保存4个月后，疫苗效价最多也只下降了0.67，效价均在5.00以上，说明冻干更有利于口服疫苗的保存，从而保证口服疫苗在冷藏情况下短期保存并不影响它的效价。15℃是疫苗野外投放的平均温度，咀嚼剂在保存2周后，疫苗效价仍然能够达到4.67，说明咀嚼剂在野外投放温度不超过15℃的情况下，其投放的有效时间可达2周。25℃和37℃情况下疫苗效价下降非常快，且温度越高，效价下降越快，差异越不明显，这与Shrivastava等人研究结果一致，因此高温季节不建议进行狂犬病口服疫苗的野外投放。

国内流浪犬猫狂犬病口服疫苗免疫尚处于探索阶段，rAd5－ΔE1/E3－CGS已被证明能产生较好的中和抗体，虽然目前病毒滴度还够高，不能满足大规模的临床应用，但梁武等人采用细胞微载体悬浮培养工艺实现了PCV2的量产，为优化rAd5ΔE1/E3CGS培养条件、提高病毒滴度、逐步实现其量产提供了研究思路。本研究为狂犬病rAd5－ΔE1/E3－CGS口服疫苗的野外释放提供了数据支撑，也为流浪动物和野生动物的狂犬病疫苗口服免疫提供了技术支持。

参考文献：略

来源：中国兽药杂志2023年4月第57卷第4期