科研动态

论文导读

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性、高度传染性的动物疾病，主要影响偶蹄动物，对农业发展造成严重影响。FMDV 属于小核糖核酸病毒科的阿夫萨病毒属，具有七个不同的血清型，且不同血清型之间没有交叉保护，这给疫苗开发带来了巨大挑战。尽管已有研究探讨了FMDV与宿主自噬作用的关系，但FMDV与非典型自噬之间的相互作用尚不明确。特别是，ATG16L1的WD40结构域在非典型自噬过程中对LC3的招募至关重要，但其在FMDV复制中的作用尚未被充分研究。

2024年8月23日，甘肃农业大学＆兰兽研在BMC Genomics在线发表了题为“Knockout of the WD40 domain of ATG16L1 enhances foot and mouth disease virus replication”的最新研究成果。该研究旨在通过CRISPR/Cas9技术敲除PK15细胞中的WD40结构域，以探讨非典型自噬对FMDV复制的影响，进而为理解病毒-宿主相互作用提供新的视角，并为防治口蹄疫提供潜在的策略。

主要研究结果

本研究中，通过CRISPR/Cas9技术成功构建了WD40结构域敲除的PK15细胞系（WD40-KO-PK15），并通过基因组测序和Western blotting验证了WD40基因的成功敲除。实验观察显示，WD40基因敲除并未影响细胞的正常生长，细胞的生长曲线与野生型PK15细胞（WT-PK15）相同。此外，通过光学显微镜观察和核型分析，WD40-KO-PK15细胞在形态和染色体结构或数量上与WT-PK15细胞没有显著差异。这些结果表明，WD40基因敲除的细胞系在形态和染色体水平上保持稳定，为后续研究FMDV复制的影响提供了可靠的细胞模型。

图1.PK 15细胞敲除WD40的鉴定

图2.细胞形态分析

2.WD 40敲除增强FMD复制

在本研究中，通过观察细胞病变效应（CPE）来评估WD40敲除对FMDV复制的影响。WD40-KO-PK15细胞与WT-PK15细胞相比，在感染FMDV后展现出更明显的CPE，且WD40-KO-PK15细胞中FMDV阳性细胞的数量是WT-PK15细胞的2.5倍。进一步的实验表明，WD40-KO-PK15细胞中FMDV的VP1蛋白和LC3 II的表达增加，病毒mRNA水平和病毒滴度也显著高于WT-PK15细胞。此外，通过RNA干扰技术敲低WD40后，PK15细胞中FMDV的复制同样增强。这些结果表明，WD40的缺失或抑制显著促进了FMDV在PK15细胞中的复制，揭示了WD40在宿主抗病毒反应中的潜在作用。

图3.口蹄疫病毒的生长特征

图4.WD 40敲除增强FMD复制

图5.通过SiRNA敲除WD 40显着增强了FMDV在PK-15细胞中的复制

3.WT-PK 15和WD 40-KO-PK 15在FMTD感染下的基因表达差异

在本研究中，通过比较WT-PK15细胞和WD40-KO-PK15细胞在FMDV感染后的基因表达差异，共鉴定出3982个差异表达基因（DEGs）。其中，1809个基因在WD40-KO-PK15细胞中上调，而2173个基因下调。这些DEGs涉及23个生物学过程和50个信号通路。KEGG分析显示，与自噬、NOD样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、RIG-I样受体信号通路、Toll样受体信号通路、mTOR信号通路、TNF信号通路、内吞作用和溶酶体等相关的DEGs数量分别为51、24、21、19、18、17、14、10和4个。此外，还涉及了MAPK信号通路、NOD样受体信号通路和NF-κB信号通路等。通过qRT-PCR验证了转录组分析结果，随机选择的与免疫反应相关的基因在FMDV感染的WT-PK15和WD40-KO-PK15细胞中的表达差异与转录组分析一致。这些发现表明，WD40-KO-PK15细胞是研究FMDV感染和宿主抗病毒反应的有效工具。

图6.WT-PK 15和WD 40-KO-PK 15感染FMD后基因表达差异

图7.RT-qPCR验证RN-seq数据

研究总结

本研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了WD40结构域敲除的PK15细胞系（WD40-KO-PK15），并证实了WD40基因的敲除对细胞的正常生长和染色体稳定性没有负面影响。通过对比WD40-KO-PK15细胞和野生型PK15细胞在FMDV感染后的表现，研究发现WD40基因的敲除显著增强了FMDV的复制能力，这表明WD40在抑制FMDV复制中发挥着重要作用。

进一步的基因表达分析揭示了在WD40-KO-PK15细胞中与自噬、免疫反应和信号转导相关的多个基因表达发生了显著变化。这些差异表达基因的鉴定为理解非典型自噬在FMDV感染中的角色提供了新的分子证据，并可能揭示了宿主细胞内抗病毒防御机制的新途径。

综上所述，WD40-KO-PK15细胞系的建立不仅为研究FMDV的复制机制提供了一个有价值的模型，而且为开发针对口蹄疫的新型预防和治疗策略奠定了基础。这些发现强调了非典型自噬在病毒感染中的重要性，并可能有助于设计针对FMDV及其他病毒性疾病的干预措施。

https://doi.org/10.1186/s12864-024-10703-6