技术交流

国家猪瘟参考实验室刘业兵团队对重要人兽共患病“尼帕病毒”的检测技术研究进行综述，并在中国兽药杂志刊发，李芳韬博士为第一作者。尼帕病毒（Nipah virus, NiV）是一种人畜共患的高致病性病毒，人感染NiV后，死亡率接近40%；猪作为中间宿主，感染NiV后具有高发病率和高死亡率特点。近年来，NiV疫情在我国相邻的多个东南亚国家频繁出现，预示该病传入我国风险日益增高。

近年来NiV在血清学诊断和分子学诊断技术方面的研究进展，包括临床常用的传统技术，以及重组蛋白ELISA、Luminex、二代测序等新兴诊断方法，为临床样本中NiV的鉴定和监测方法更新换代提供参考，对监测NiV从国外的传入情况、防控猪群NiV疫情发生以及守护公共卫生安全具有重大意义。

NiV血清学传统诊断方法主要包括ELISA和血清中和试验，常用靶标为NiV的F蛋白、G蛋白和N蛋白。其中，血清中和试验需要在生物安全四级实验室中进行，是NiV实验室诊断的“黄金”标准；ELISA是一种安全性好、敏感性高、特异性强和经济实惠的诊断工具，可用于临床样本的大规模流行病学调查和持续监测。目前，检测NiV常用ELISA方法包括捕获ELISA检测IgM抗体和间接ELISA检测IgG抗体。以往研究表明，第一代间接ELISA结果存在非特异性反应，须由在生物安全四级实验室中操作的血清中和试验进一步确定ELISA结果，使NiV阳性样本的筛选不具有普适性。因此，开发和评价用于筛查NiV疑似病例的ELISA新方法，有助于监测猪群NiV疫情以及制定公共卫生预防措施。随着诊断技术的发展和进步，近些年来逐渐研发出更多适用于NiV疫情监测的新方法，对于新技术的开发使现有的血清学分析得以改进，主要包括以下技术：

1.1 基于重组蛋白的ELISA鉴别方法

由于NiV具有高度危险性，利用重组蛋白代替全病毒作为ELISA检测抗原，可适用于临床样本的流行病学调查。NiV的G蛋白和N蛋白可以用于建立NiV间接ELISA检测方法，进行阳性血清的筛选以及NiV与亨德拉病毒(HendraVirus,HeV)的鉴别诊断。使用不同的表达系统表达HeV和NiV截短形式的G蛋白以及NiV的全长N蛋白，以这些重组蛋白为基础，采用ELISA检测猪血清中HeV或NiV特异性抗体,以达到鉴定NIV或HeV目的。因为HeV和NiV的交叉反应性，可以通过使用基于全长N蛋白的ELISA对血清进行初筛，然后再用基于截短G蛋白的ELISA区分HeV和NiV感染。但是HeV和NiV均属亨德拉尼帕病毒属，抗原之间密切相关，为了排除交叉反应与假阳性现象，仍需进行血清中和试验才能确认为NiV阳性。

1.2 基于NiV-g蛋白多克隆抗体的抗原捕获夹心ELISA

采用基于NiV-g蛋白多克隆抗体的抗原捕获夹心ELISA方法，可以用于检测咽拭子、鼻拭子、脑脊液、尿液和血液中的NiV感染。经研究表明，该方法能够更快速地诊断常规PCR方法无法检测到的新型NiV。虽然PCR是诊断NiV感染最敏感的技术，但当病毒变异后，可能会造成PCR鉴定方法失效。因此，这种基于NiV-g蛋白多克隆抗体的抗原捕获夹心ELISA方法可以在血清学层面鉴定到新型NiV感染，补充传统血清学方法和PCR方法在检测过程中可能遗漏的阳性病例。

1.3 Luminex测定抗体法血清学诊断方法

除了传统的ELISA和血清中和试验诊断方法，还有一种Luminex测定法已开发用于NiV的血清学检测，包括设计用于抗体检测和鉴别的Luminex结合测定法，以及设计用于病毒中和的Luminex阻断测定法。该技术通过在不同荧光编码的微球上进行抗原－抗体结合反应，运用激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多种不同的生物学反应，可同时检测上百种生物靶标，并且在数小时内完成检测。通过对临床样本的筛选结果进行比较，结合测定法和阻断测定法可以替代传统的ELISA和血清中和试验。因此，Luminex测定法是一种快速、灵敏、特异的检测临床样本血清中NiV的有效替代方法。并且该方法不需要在活细胞上培养病毒，无需在生物安全四级实验室中进行，适用于临床疾病诊断和流行病学监测可能需要的大批量操作条件。

ELISA可以用来准确测定大批量生物样品，但传统ELISA只能分析一个目标分子，不具备同时分析多种目标分子的能力。在ELISA基础上发展的Luminex测定法不仅可以替代传统方法，还可以在一次实验中完成对多种目标分子的分析，从而建立了更加高效、快速的分析平台。

1.4 基于假病毒的中和试验

由于NiV中和试验不具有普适性，因此可以通过构建NiV假病毒，设计基于假病毒的NiV中和试验。已有研究通过基因重组技术构建了单独表达F或G蛋白的重组水泡性口炎病毒作为已知抗原，并在此基础上建立了检测NiV抗体的空斑抑制试验；或利用基因重组技术构建了共表达F、G蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)的重组水泡性口炎病毒，作为已知病毒抗原检测NiV血清样本。上述表达绿色荧光蛋白或荧光素酶的NiV假病毒被称为第一代假病毒。在检测过程中，基于NiV第一代假病毒的中和试验仍需要特定的检测设备以检测荧光蛋白或荧光素酶。所以，在上述假病毒的基础上，NiV第二代假病毒采用表达分泌型碱性磷酸酶的水泡性口炎病毒模型重组F和G蛋白，通过使用ELISA酶标仪测量上清液中的分泌型碱性磷酸酶活性，从而开发出一种新型的基于NiV假病毒的血清中和试验检测方法，其结果与传统的活体NiV试验获得的抗体检测结果一致。

分子学诊断方法主要包括一系列针对病毒核酸的检测方法，除了传统PCR方法外，还有实时荧光逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)、多重PCR、逆转录PCR和双重套式RT-PCR等方法，以及多种核酸测序方法。在临床上，通过采集脑、肺、脾脏或淋巴结等组织，可用于NiV的初筛及进一步鉴定。针对NiV的M、N和P基因保守区域设计引物监测疑似NiV感染样本，常用于东南亚地区爆发NiV疫情时的病毒鉴定。其中，qRT-PCR作为目前应用最为普遍的分子学诊断方法,已被证明比传统PCR灵敏1000倍，因此在多次疫情爆发时使用,其批间和批内差异小、重复性好、操作简单、安全、快速，已成为病原分子诊断的金标准。除了PCR方法外，还有更多新兴分子学方法可以用于NiV诊断，主要包括以下技术：

2.1Luminex测定核酸法Luminex测定法

除了可以应用于NiV的血清学检测，还可以应用于NiV的核酸检测，对HeV和NiV分离株进行检测和鉴别，并且检测灵敏度与qPCR相当。已有研究通过利用低聚标记微球构建了用于HeV和NiV检测和鉴别的多重鉴定方法，针对N蛋白和P蛋白编码基因的多个位点构建Luminex测定法，使微球悬浮阵列系统能够在一次反应中同时识别多个核苷酸靶标，其结果与已有的qPCR相比，Luminex测定法可明确鉴别HeV和NiV感染病例，并且HeV检测的敏感性与qPCR相当，具有较高的分析和诊断特异性和敏感性。

2.2二代测序

基于PCR结果的一代测序在过去NiV的发现和诊断中起关键作用，对NiV扩增产物的测序可以进一步证实检测结果，并且对研究病毒基因突变和病毒基因演化方面具有重要作用。随着二代测序的普遍应用，相比于一代测序大幅降低了经济成本，并且在保持测序准确性的同时，大幅降低了测序时间。利用二代测序从初筛阳性的样本中获取NiV全长基因组，以及鉴定新型NiV毒株，是目前最快捷、有效的诊断与分析流程。

随着技术的进一步发展，具有巨大测序深度的高通量测序，在排除大量宿主及环境背景信息的干扰后能够检测到较小基因组的病毒，可以不进行PCR步骤、直接在临床和环境样本中检测NiV核酸，为更加直接、精确地从样本中鉴定NiV基因信息提供了技术支持。该深度测序诊断方法设计了基于生物素化RNA诱饵原理的病毒富集板，能够特异性捕获并富集宏基因组中的病毒信号，可显著提高检测背景信息复杂临床样品的敏感性，对于感染多种病原的样本，能够同时检测到不同种病原的遗传信息。

血清中和试验虽然是NiV实验室诊断的“黄金”标准，但是在临床采样检测和攻毒实验中，血清中和试验的检测阳性率低于qRT-PCR和ELISA检测阳性率。ELISA试验作为普遍应用的血清学检测方法，无需在生物安全四级实验室中即可进行检测；然而，其敏感性和特异性略低于分子检测技术，如RT-PCR、qRT-PCR和其他分子生物学方法，无法快速、敏感和特异性地检测到NiV。在NiV疫情再次爆发时，PCR方法和基因组测序结果对于NiV的遗传学分析和分子特征研究是必不可少的，但是由于引物靶向序列的局限性，PCR诊断方法无法适应病毒的快速变异，可能会造成PCR鉴定方法失效。因此，只有将多种检测方法相结合，才能更加快速、高效地诊断NiV,对防控猪群NiV疫情发生、监测NiV从国外的传入情况以及守护公共卫生安全具有重大意义。

在目前的研究中，为了更精确的筛查临床样本中的NiV阳性病例，可先采用qRT-PCR方法初步筛选大量临床样本中的阳性样本，再采用ELISA方法对阳性样本的血清抗体进行进一步筛选及确认，最后利用二代测序(NGS)对组织和拭子样本进行NiV的全基因组测序。随着NiV假病毒相关研究的进一步发展，NiV的血清中和试验无需在生物安全四级实验室中进行，使血清中和试验作为NiV实验室诊断的“黄金”标准有望在日后进一步推广；而具有巨大测序深度的高通量测序，能够排除大量宿主及环境背景信息的干扰，并且可以不进行PCR步骤、直接在临床和环境样本中检测NiV核酸，为更加直接、精确地从样本中鉴定NiV基因信息提供了技术支持，也有利于NiV检测进一步从实验室推广到临床。

NiV的高发病率和高死亡率，对养殖业和公共卫生安全构成了重大威胁。目前，通过临床症状难以鉴别NiV与猪群中长期存在的呼吸道症状为主要表征的病毒，为临床诊断NiV造成了巨大困难。所以，在发展实验室诊断技术的同时，应进一步简化操作步骤，发展易于临床操作的快速诊断分析技术，以降低我国NiV流行的潜在风险，防控该病的输入与爆发。